摘要：目的 根據(jù)向量夾角法，利用計算機自動計算兩個分析指紋圖譜間的相似度。方法 將色譜指紋圖譜看作多維空間內(nèi)的向量，利用向量夾角余弦的基本公式計算兩個指紋圖譜間的相似度；用VB6.0編程自動完成色譜峰匹配并計算相似度。結(jié)果 采用11個不同產(chǎn)地及炮制方法的吳茱萸(供|求|鋪|資|價|科|手機訂閱)樣品的液相色譜指紋圖譜對計算方法及程序進行了檢驗，結(jié)果表明該程序能較好的定量評價指紋圖譜間的相似性，并清楚地區(qū)別了湯洗7遍這種炮制方法對指紋圖譜的影響。 結(jié)論 此法能較好地定量評價指紋圖譜間的相似性，可應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制。
關(guān)鍵詞：中藥；吳茱萸；指紋圖譜；向量夾角法；質(zhì)量控制
指紋圖譜是近年來中藥質(zhì)量控制的熱點，對中藥材及成藥來說，用指紋譜進行質(zhì)量控制、判別真?zhèn)问且环N很有前途的方法。目前根據(jù)整體譜圖進行質(zhì)量控制的數(shù)據(jù)處理方法主要有模式識別與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法[1-3]，這兩種方法都是采用計算機自動尋找大量樣本譜圖的統(tǒng)計規(guī)律，再根據(jù)所建立的規(guī)律對待測譜圖進行歸類，它們給出的答案是一種分類及定性的信息，不直接定量比較兩張指紋圖譜間的相似度。但在很多情況下我們需要利用這種相似度的計算提供定量的評價信息，為中藥質(zhì)量控制提供依據(jù)。目前主要采用峰重疊率來表征譜圖的相似度[4,5]，這個方法在計算時僅考慮出峰的數(shù)目而不考慮峰的強度。為了能夠全面反映出峰數(shù)目與峰強對指紋譜間相似度的影響，本文在多維空間向量夾角[6]的基礎(chǔ)上提出了計算色譜指紋圖譜之間相似度的方法，為中藥指紋圖譜質(zhì)量評價提供了一個新方法。
基本原理 N個數(shù)值組成的行(x1, x2, x3,… xn)稱為N維向量簡記為大寫字母X，定義 為向量X的模。如果存在兩個向量X及Y則 稱為X與Y的內(nèi)積，X,Y之間的向量夾角按照(1)式計算。如果 越接近1則說明兩個向量越相似[6]。 (1) 每個色譜指紋圖譜都可以看作一組對應(yīng)保留時間下的峰高(或峰面積)的數(shù)值，可把這組數(shù)值看作多維空間中的向量，使兩個指紋圖譜間相似性的問題轉(zhuǎn)化為多維空間的兩個向量的相似性問題，利用(1)式能夠計算 來定量表征指紋圖譜間的相似性。下面舉一個簡單的例子進一步說明向量夾角余弦的具體計算過程。假設(shè)有兩張色譜圖，每張色譜圖包含4個色譜峰，3個是共有峰，此外每張譜圖各有1個特有峰。第一張譜圖共有峰的峰高按順序為40，70，25；第二張譜圖共有峰的峰高按順序為39，71，24；第1張譜圖特有峰的峰高是5；第2張譜圖特有峰的峰高是7。則第1張譜圖的向量是(40,70,25,5,0)；第2張譜圖的向量是(39,71,24,0,7), 向量夾角余弦的計算如下： =0.995。即兩個假設(shè)譜圖的相似度是0.995。
實際的指紋圖譜往往有幾十、上百個色譜峰，手工比較判斷共有峰與特有峰以及計算相似度是煩瑣的，因此本文使用VB6.0編制了一個小程序，只要給出兩個色譜圖的積分報告就能自動進行峰匹配，判斷共有峰及特有峰，并將對應(yīng)的數(shù)值填入向量的對應(yīng)位置，計算相似度。實際計算中藥指紋圖譜相似度主要有以下4個步驟： (1) 在統(tǒng)一的樣品處理與分析測試條件下獲得色譜指紋圖譜；(2) 進行譜圖積分獲得保留時間、峰高等信息；(3)根據(jù)分析時的噪聲水平，將信噪比<5的色譜峰除去不作考慮；(4)用計算機自動進行兩個指紋圖譜之間的峰匹配，并利用(1)式計算 。
材料與方法 藥材樣品：11種吳茱萸藥材樣品，產(chǎn)地與炮制方法分別是：廣西上林湯洗7遍；湖南懷化；湖南新晃甘草(供|求|鋪|資|價|科|手機訂閱)炮制；廣西灌陽縣；四川廣元；廣西百色；廣西文市鎮(zhèn)；廣西灌陽茶用；廣西上林甘草炮制；廣西凌云仰村；貴州遵義。所有樣品均由沈陽藥科大學畢開順教授鑒定并提供。
儀器及分析條件：Waters Alliance 2690 液相色譜系統(tǒng)；996二極管陣列紫外檢測器(美國Waters 公司 )，Intersil ODS－3柱(4.6mm×250mm)，檢測波長為280nm。進樣量2μL。流動相A為甲醇，流動相B為含0.3％醋酸氨的水溶液。二元梯度分離，流速1.0mL·min-1，梯度條件：0-5min A:5%,5-50min A:5％-100%，50-60min A:100%。樣品處理：稱取吳茱萸果實4.00g加入40％乙醇水溶液100mL，回流2h，冷卻后放入冰箱冷凍4h，過濾定容至100mL。取10mL過0.45μm濾膜待液相色譜分析。
結(jié)果與討論：
1相同操作條件下不同樣品色譜指紋譜的自動峰識別及匹配雖然采用的數(shù)據(jù)處理模式各有不同，但在已有的有關(guān)色譜指紋譜質(zhì)量控制的工作中，基本采用人工進行色譜指紋譜的峰識別及匹配后將峰高(或峰面積)數(shù)值輸入電腦進行數(shù)據(jù)處理。這種做法不適于把指紋譜質(zhì)量控制真正運用于實際。人工比對、手工輸入既煩瑣又容易出錯，本文提出了一套方法及原則，并編程實現(xiàn)了對11種吳茱萸樣品液相色譜指紋圖譜(見圖1)的自動峰匹配。 隨著分析儀器技術(shù)的進步，分析儀器上保留時間的重復性越來越好，只要嚴格控制色譜條件就能夠保證色譜峰的出峰次序不變并且保留時間差異較小， 對液相色譜即使在梯度分離的條件下保留時間差別小于1min是容易做到的，對氣相色譜而言保留時間的差異甚至小于2s，在這種情況下用計算機進行色譜峰的匹配也是能夠做到的。以液相色譜的峰匹配為例，液相色譜的峰寬最小在0.3min左右，如果僅考慮保留時間差別小于1min這個條件則對第一張譜圖的每個色譜峰在第二張色譜圖上能找到0到3個峰與之對應(yīng)(1min內(nèi)最多出3個峰)，也就是說每個色譜峰的峰匹配可能性有0－3個，把全體色譜峰的匹配可能性排列組合就可列出所有可能的譜圖匹配結(jié)果，當然有的匹配結(jié)果違反色譜峰流出次序不變的原則應(yīng)被排除，在剩下的其它匹配結(jié)果中，挑選相似度最大的匹配結(jié)果作為答案輸出。由于對應(yīng)的色譜峰峰高越接近則相似度的計算結(jié)果越好，挑選峰高最接近的匹配結(jié)果就可以保證相似度的計算結(jié)果最大，這樣可以減小運算量加快程序的運行速度。
本文提出的程序是在下列三條原則的基礎(chǔ)上進行峰匹配(流程圖見圖2)：
(1) 同一分析條件下兩張指紋譜對應(yīng)色譜峰的保留時間差異在合理的范圍以內(nèi)。(視具體情況而定，本文吳茱萸指紋譜的例子中保留時間差異小于1min)；
(2) 同一分析條件下兩張指紋譜的出峰次序不變。
(3) 在滿足(1) 、(2)的同時尋找使相似度最大(峰高最接近)的峰匹配結(jié)果。以灌陽與廣元樣品為例詳細說明在保留時間漂移的情況下本程序是如何進行峰匹配、并給出正確的匹配結(jié)果。
眾所周知，人工比較譜圖進行峰匹配的做法主要是依據(jù)保留時間，在保留時間有漂移的情況下用計算機尋找相似度最大的峰匹配結(jié)果會比人工比較更可靠。此外人工比較時通常只比較大一點的色譜峰而忽略小峰，而計算機比較則可以把小色譜峰也考慮在內(nèi)，這樣的計算結(jié)果能反應(yīng)譜圖的細微差別。四川廣元樣品與廣西灌陽樣品的譜圖在直觀上看來是比較相似的，如果僅考慮信噪比>30的色譜峰則它們的相似度計算結(jié)果為95%，而如果考慮所有信噪比>5的色譜峰則相似度計算結(jié)果是89%，從這個結(jié)果看考慮小峰的差別能更精細的反應(yīng)譜圖的不同。一般來說不同品種的藥材其指紋圖譜差異較大而相同品種的藥材指紋圖譜差異較小因此本方法也有可能用作區(qū)分不同品種及產(chǎn)地的藥材。如果利用多種道地藥材的標準提取物建立了標準譜圖，那么通過待測樣品與標準譜圖的相似度比較有可能判斷樣品究竟是哪一種藥材，這也是今后進一步研究的目標。 3 向量夾角余弦法與其它數(shù)據(jù)處理方法的比較 向量夾角余弦法數(shù)學概念簡單、數(shù)據(jù)處理過程簡便快速，在定量計算兩張色譜指紋譜相似度方面有其優(yōu)勢，但在數(shù)據(jù)分類、特征變量的提取等其它方面，還是傳統(tǒng)的模式識別及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法更有效，將來的質(zhì)量控制也許應(yīng)當將兩者結(jié)合起來，發(fā)揮各自的優(yōu)勢，共同解決指紋譜質(zhì)量控制的難題。
關(guān)鍵詞：中藥；吳茱萸；指紋圖譜；向量夾角法；質(zhì)量控制
指紋圖譜是近年來中藥質(zhì)量控制的熱點，對中藥材及成藥來說，用指紋譜進行質(zhì)量控制、判別真?zhèn)问且环N很有前途的方法。目前根據(jù)整體譜圖進行質(zhì)量控制的數(shù)據(jù)處理方法主要有模式識別與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法[1-3]，這兩種方法都是采用計算機自動尋找大量樣本譜圖的統(tǒng)計規(guī)律，再根據(jù)所建立的規(guī)律對待測譜圖進行歸類，它們給出的答案是一種分類及定性的信息，不直接定量比較兩張指紋圖譜間的相似度。但在很多情況下我們需要利用這種相似度的計算提供定量的評價信息，為中藥質(zhì)量控制提供依據(jù)。目前主要采用峰重疊率來表征譜圖的相似度[4,5]，這個方法在計算時僅考慮出峰的數(shù)目而不考慮峰的強度。為了能夠全面反映出峰數(shù)目與峰強對指紋譜間相似度的影響，本文在多維空間向量夾角[6]的基礎(chǔ)上提出了計算色譜指紋圖譜之間相似度的方法，為中藥指紋圖譜質(zhì)量評價提供了一個新方法。
基本原理 N個數(shù)值組成的行(x1, x2, x3,… xn)稱為N維向量簡記為大寫字母X，定義 為向量X的模。如果存在兩個向量X及Y則 稱為X與Y的內(nèi)積，X,Y之間的向量夾角按照(1)式計算。如果 越接近1則說明兩個向量越相似[6]。 (1) 每個色譜指紋圖譜都可以看作一組對應(yīng)保留時間下的峰高(或峰面積)的數(shù)值，可把這組數(shù)值看作多維空間中的向量，使兩個指紋圖譜間相似性的問題轉(zhuǎn)化為多維空間的兩個向量的相似性問題，利用(1)式能夠計算 來定量表征指紋圖譜間的相似性。下面舉一個簡單的例子進一步說明向量夾角余弦的具體計算過程。假設(shè)有兩張色譜圖，每張色譜圖包含4個色譜峰，3個是共有峰，此外每張譜圖各有1個特有峰。第一張譜圖共有峰的峰高按順序為40，70，25；第二張譜圖共有峰的峰高按順序為39，71，24；第1張譜圖特有峰的峰高是5；第2張譜圖特有峰的峰高是7。則第1張譜圖的向量是(40,70,25,5,0)；第2張譜圖的向量是(39,71,24,0,7), 向量夾角余弦的計算如下： =0.995。即兩個假設(shè)譜圖的相似度是0.995。
實際的指紋圖譜往往有幾十、上百個色譜峰，手工比較判斷共有峰與特有峰以及計算相似度是煩瑣的，因此本文使用VB6.0編制了一個小程序，只要給出兩個色譜圖的積分報告就能自動進行峰匹配，判斷共有峰及特有峰，并將對應(yīng)的數(shù)值填入向量的對應(yīng)位置，計算相似度。實際計算中藥指紋圖譜相似度主要有以下4個步驟： (1) 在統(tǒng)一的樣品處理與分析測試條件下獲得色譜指紋圖譜；(2) 進行譜圖積分獲得保留時間、峰高等信息；(3)根據(jù)分析時的噪聲水平，將信噪比<5的色譜峰除去不作考慮；(4)用計算機自動進行兩個指紋圖譜之間的峰匹配，并利用(1)式計算 。
材料與方法 藥材樣品：11種吳茱萸藥材樣品，產(chǎn)地與炮制方法分別是：廣西上林湯洗7遍；湖南懷化；湖南新晃甘草(供|求|鋪|資|價|科|手機訂閱)炮制；廣西灌陽縣；四川廣元；廣西百色；廣西文市鎮(zhèn)；廣西灌陽茶用；廣西上林甘草炮制；廣西凌云仰村；貴州遵義。所有樣品均由沈陽藥科大學畢開順教授鑒定并提供。
儀器及分析條件：Waters Alliance 2690 液相色譜系統(tǒng)；996二極管陣列紫外檢測器(美國Waters 公司 )，Intersil ODS－3柱(4.6mm×250mm)，檢測波長為280nm。進樣量2μL。流動相A為甲醇，流動相B為含0.3％醋酸氨的水溶液。二元梯度分離，流速1.0mL·min-1，梯度條件：0-5min A:5%,5-50min A:5％-100%，50-60min A:100%。樣品處理：稱取吳茱萸果實4.00g加入40％乙醇水溶液100mL，回流2h，冷卻后放入冰箱冷凍4h，過濾定容至100mL。取10mL過0.45μm濾膜待液相色譜分析。
結(jié)果與討論：
1相同操作條件下不同樣品色譜指紋譜的自動峰識別及匹配雖然采用的數(shù)據(jù)處理模式各有不同，但在已有的有關(guān)色譜指紋譜質(zhì)量控制的工作中，基本采用人工進行色譜指紋譜的峰識別及匹配后將峰高(或峰面積)數(shù)值輸入電腦進行數(shù)據(jù)處理。這種做法不適于把指紋譜質(zhì)量控制真正運用于實際。人工比對、手工輸入既煩瑣又容易出錯，本文提出了一套方法及原則，并編程實現(xiàn)了對11種吳茱萸樣品液相色譜指紋圖譜(見圖1)的自動峰匹配。 隨著分析儀器技術(shù)的進步，分析儀器上保留時間的重復性越來越好，只要嚴格控制色譜條件就能夠保證色譜峰的出峰次序不變并且保留時間差異較小， 對液相色譜即使在梯度分離的條件下保留時間差別小于1min是容易做到的，對氣相色譜而言保留時間的差異甚至小于2s，在這種情況下用計算機進行色譜峰的匹配也是能夠做到的。以液相色譜的峰匹配為例，液相色譜的峰寬最小在0.3min左右，如果僅考慮保留時間差別小于1min這個條件則對第一張譜圖的每個色譜峰在第二張色譜圖上能找到0到3個峰與之對應(yīng)(1min內(nèi)最多出3個峰)，也就是說每個色譜峰的峰匹配可能性有0－3個，把全體色譜峰的匹配可能性排列組合就可列出所有可能的譜圖匹配結(jié)果，當然有的匹配結(jié)果違反色譜峰流出次序不變的原則應(yīng)被排除，在剩下的其它匹配結(jié)果中，挑選相似度最大的匹配結(jié)果作為答案輸出。由于對應(yīng)的色譜峰峰高越接近則相似度的計算結(jié)果越好，挑選峰高最接近的匹配結(jié)果就可以保證相似度的計算結(jié)果最大，這樣可以減小運算量加快程序的運行速度。
本文提出的程序是在下列三條原則的基礎(chǔ)上進行峰匹配(流程圖見圖2)：
(1) 同一分析條件下兩張指紋譜對應(yīng)色譜峰的保留時間差異在合理的范圍以內(nèi)。(視具體情況而定，本文吳茱萸指紋譜的例子中保留時間差異小于1min)；
(2) 同一分析條件下兩張指紋譜的出峰次序不變。
(3) 在滿足(1) 、(2)的同時尋找使相似度最大(峰高最接近)的峰匹配結(jié)果。以灌陽與廣元樣品為例詳細說明在保留時間漂移的情況下本程序是如何進行峰匹配、并給出正確的匹配結(jié)果。
眾所周知，人工比較譜圖進行峰匹配的做法主要是依據(jù)保留時間，在保留時間有漂移的情況下用計算機尋找相似度最大的峰匹配結(jié)果會比人工比較更可靠。此外人工比較時通常只比較大一點的色譜峰而忽略小峰，而計算機比較則可以把小色譜峰也考慮在內(nèi)，這樣的計算結(jié)果能反應(yīng)譜圖的細微差別。四川廣元樣品與廣西灌陽樣品的譜圖在直觀上看來是比較相似的，如果僅考慮信噪比>30的色譜峰則它們的相似度計算結(jié)果為95%，而如果考慮所有信噪比>5的色譜峰則相似度計算結(jié)果是89%，從這個結(jié)果看考慮小峰的差別能更精細的反應(yīng)譜圖的不同。一般來說不同品種的藥材其指紋圖譜差異較大而相同品種的藥材指紋圖譜差異較小因此本方法也有可能用作區(qū)分不同品種及產(chǎn)地的藥材。如果利用多種道地藥材的標準提取物建立了標準譜圖，那么通過待測樣品與標準譜圖的相似度比較有可能判斷樣品究竟是哪一種藥材，這也是今后進一步研究的目標。 3 向量夾角余弦法與其它數(shù)據(jù)處理方法的比較 向量夾角余弦法數(shù)學概念簡單、數(shù)據(jù)處理過程簡便快速，在定量計算兩張色譜指紋譜相似度方面有其優(yōu)勢，但在數(shù)據(jù)分類、特征變量的提取等其它方面，還是傳統(tǒng)的模式識別及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法更有效，將來的質(zhì)量控制也許應(yīng)當將兩者結(jié)合起來，發(fā)揮各自的優(yōu)勢，共同解決指紋譜質(zhì)量控制的難題。
