抗菌肽(ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｅｐｔｉｄｅ)是具抗菌活性的小分子蛋白質,是宿主先天性非特異性防御系統的重要組分。迄今為止在昆蟲、被囊動物、鳥類、哺乳動物、植物等多種生物中發現了100多種內源性抗菌肽。抗菌肽具有分子量小,理化性質穩定,抗菌譜廣及材料來源豐富等優點,抗菌肽不僅能作用于細菌、真菌、病毒以及其他一些原核生物,對腫瘤治療也有一定的作用?？咕膶ι锏奶烊幻庖咂痍P鍵作用。20世紀80年代初,Ｓｔｅｉｎｅｒ[1]及Ｓａｌｓｔｅｄ等[2]首次分離到昆蟲的抗菌多肽天蠶素(ｃｅｃｒｏｐｉｎ)和防御素(ｄｅｆｅｎｓｉｎ),從此人們開始關注這類抗菌多肽,研究了其遺傳免疫性、寄主防御系統、膜蛋白的相互作用、蛋白的修飾和分泌等,從而將這些抗菌多肽開發成有應用價值的食品添加劑和藥物。
1 昆蟲抗菌肽的種類
昆蟲產生的抗菌多肽是昆蟲免疫的效應物。昆蟲的抗菌肽屬陽離子堿性多肽,大致可分為以下4類:第一類是天蠶素,含有31～39個氨基酸殘基,一般不含有半胱氨酸,由鱗翅目和雙翅目昆蟲產生。第二類是昆蟲防御素,含有38～43個氨基酸殘基,其結構與動物和某些植物的防御素相似。防御素大量存在于昆蟲血淋巴液中,至今已在雙翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目和蜻蜓目中發現了30多種防御素,主要殺死革蘭氏陽性菌。最近從果蠅中分離到抗菌多肽ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ,有38%的氨基酸序列與植物防御素相似,表明其與植物多肽的進化有一定的同源關系。第三類是分子量為2～4ｋＤ富含脯氨酸和精氨酸的抗菌肽,如從意大利蜜蜂中分離到的蜜蜂肽ａｐｉｄａｅｃｉｎ和ａｂａｅｃｉｎ(分子量分別為2.0ｋＤ和4.0ｋＤ)等,該類抗菌肽主要抑制革蘭氏陰性菌。第四類是分子量為8～30ｋＤ,富含甘氨酸的蛋白,如從麻蠅幼蟲體內分離到的麻蠅毒 素Ⅱ(ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎⅡ,分子量約為27ｋＤ),從綠蠅幼蟲、粉甲幼蟲蟲體中分離到的雙翅肽ｄｉｐｔｅｒｉｃｉｎ(分子量約為9ｋＤ)和鞘翅肽ｃｏｌｅｏｐｔｅｒｉｃｉｎ等,這些大肽間相互關系較遠,屬樗蠶素(ａｔｔａｃｉｎ)的超家族成員。
2 昆蟲抗菌肽的抗菌作用機理
昆蟲受傷后能誘導血細胞和脂肪體迅速產生并釋放大量不同組分抗菌肽進入血液,殺死外來細菌,這些抗菌肽合成類似于免疫應答反應和哺乳動物急性期反應。這些基因的表達受κＢ相關模式調控元件,與哺乳動物中相類似的調節編碼免疫和應急期蛋白基因的ＮＦ κＢ相關的反式激活蛋白二者共同調控[3]。
當抗菌肽基因在體內通過細菌的脂多糖類(ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ,ＬＰＳ)或死亡的細胞誘導表達時,外來的刺激信號激活轉錄激活因子ＮＦ κＢ,激活的ＮＦ κＢ識別并結合到抗菌肽基因5′Ｂ 上游的一段特定區域,從而激活抗菌肽基因的表達[4,5]。表達后產生的抗菌肽在水溶液中沒有穩定的構象,只是在結合或接近細胞膜時才形成高級結構。對此有學者分別提出各自的觀點:Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ等[6]認為,當抗菌肽與細胞膜疏水區域接觸時,整個分子(從Ｎ端到Ｃ端)誘導出兩親性螺旋,抑菌過程可能首先是抗菌肽Ｎ端的帶電氨基酸與細胞膜的極性集團靜電吸引,并形成α 螺旋,沿螺旋軸翻轉,嵌入細胞膜,破壞膜結構。Ｆｉｎｋ等[7]研究表明,抗菌肽Ｎ端(殘基1～11)形成兩親性螺旋,中間部分(殘基12～24)形成彈性轉角,Ｃ端形成疏水螺旋。當抗菌肽作用于細胞膜時,Ｃ端疏水螺旋插入膜中,Ｎ端結合在膜表面,中間由彈性轉角相連。Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等[8]提出,抗菌肽通過靜電作用被吸引到膜表面,然后疏水性尾巴插入細胞膜中的疏水區域,通過改變膜構象,多個抗菌肽聚合在膜上形成離子通道。在上述的4類抗菌多肽中,天蠶素和防御素的抗菌機理研究得最為詳細。
2.1 天蠶素的抗菌機理
天蠶素為陽離子型分子,含有2個α 螺旋結構,此結構具有雙親和性。Ｎ 末端具有親水性并含堿性氨基酸。含有堿性氨基酸的堿性部位與細菌細胞膜的磷脂親和,疏水部位貫穿細菌細胞膜,從而使細菌細胞膜的電動勢消失,ＡＴＰ含量迅速減少,這樣使細菌細胞膜機能喪失,細菌死亡。Ｃ 末端氨基酸的酰氨化對于抗菌蛋白保持其抗菌活性是極為重要的[9]。
2.2 防御素的抗菌機理
昆蟲防御素對革蘭氏陽性、陰性菌均有殺傷作用。相對而言,對革蘭氏陽性菌殺傷力更強,這可能是革蘭氏陰性菌的細胞壁防礙防御素接觸細胞膜。防御素分子含有6個半胱氨酸,形成3個二硫鍵,具有穩定的分子結構。這一結構與從哺乳動物體中分離到的防御素分子結構相同。防御素類抗菌肽的殺菌機理也是防御素分子作用于細菌細胞膜。分子中的二硫鍵與細菌細胞膜的心肌磷脂有很強的親和作用。結合后形成離子通道,從而改變細胞膜的透性,將細菌殺死。防御素的殺菌活性中心部位為α 螺旋結構[10]。Ｃ 末端氨基酸的酰氨化對其保持抗菌活性也是極為重要的。研究發現,防御素附著在細菌表面后,除了本身對細菌的損傷外,還可以使細菌被吞噬細胞吞噬消化,起到調理素的作用。另有研究表明,過氧化氫(Ｈ2Ｏ2)與防御素有協同作用,此協同作用隨Ｈ2Ｏ2濃度的增加而增加,使防御素易于進入其靶細胞膜或細胞內環境。此外,研究表明樗蠶素類抗菌肽的抗菌機理是阻礙細菌外膜蛋白的合成,富含甘氨酸類抗菌肽的抗菌機理是阻礙細菌肽聚糖的合成。
3 昆蟲抗菌肽的應用
3.1 轉抗菌肽基因植物
昆蟲抗菌肽對植物病原菌也表現出極強的抗菌活性。用基因工程方法將真核生物編碼抗菌肽的基因導入作物并得以表達,以達到抗菌的目的是當前國內外研究的熱點。Ｊａｙｍｅｓ[11]將天蠶素Ｂ基因導入煙草植株中,培育出抗煙草青枯病(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ)的煙草植株。Ｂｅｌｔａｎ等[12]將天蠶素Ｂ類似物ＳＢ 37的基因轉入煙草中,發現可推遲煙草的發病時間,并可以降低發病率和死亡率。另有報道將ａｔｔａｃｉｎＥ基因轉入蘋果樹可提高蘋果樹對梨火疫病(Ｅｒｗｉｎｉａａｍｙｌｏｖｏｒａ)的抗性[13]。最近有研究表明,編碼一種穩定的ｃｅｃｒｏｐｉｎ類似物ＭＢ39的基因在轉基因煙草中表達可抗煙草野火病(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ.ｔａｂａｃｉ)[14]。
國內也已研究出抗煙草花葉病毒病(Ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ,ＴＭＶ)的轉基因煙草。簡玉瑜等[15]將天蠶素Ｂ基因轉入水稻,培育出抗水稻白葉枯病(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ.ｏｒｙｚａｅ)的植株。賈士榮等[16]自1986年開始選定昆蟲細胞產生的抗菌肽天蠶素進行馬鈴薯抗青枯病基因工程的研究,改造并構建了比天蠶素抗性能力更強的ｃｅｃｒｏｐｉｎＢ、ｓｈｉｖａＡ及ＷＨＤ等抗菌肽基因,并導入我國7個馬鈴薯主栽品種中,轉化出1050個轉基因株系。
3.2 轉抗菌肽基因動物
控制瘧疾、黃熱病等蚊傳疾病的主要手段是開發高效的藥物和疫苗,以及消滅傳播介體(蚊等),切斷傳播途徑。近年來通過遺傳工程的方法,將對病原生物有抑制作用的抗菌肽基因導入傳播介體(蚊)中,使其在昆蟲體內高效穩定的表達,從而切斷病原物的傳播途徑[17～19]。
在天蠶素Ｂ基礎上構建的雜合肽ｓｈｉｖａ 3對瘧原蟲(Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｐｅｒｇｈｅｉ)孢子的發育有毒害作用。在ｓｈｉｖａ 3基因前連接一個谷胱苷肽(ＧＳＴ)轉移酶基因,組成融合基因Ｇｓｔ ｓｈｉｖａ 3作報告基因,從而得到一種轉基因蚊子,此蚊子腸道內可合成并分泌ｓｈｉｖａ 3,因此可以用于控制人瘧疾的傳播[18]。最近Ｖｌａｄｉｍｉｒ等[19]以埃及伊蚊(Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ)卵黃原蛋白基因(ｖｉｔｅｌ ｌｏｇｅｎｉｎｇｅｎｅ,ｖｇ)啟動子連接一段防御素Ａ(ｄｅｆｅｎｓｉｎＡ,ＤｅｆＡ)基因,將ｖｇ ＤｅｆＡ整合到埃及伊蚊的基因組中,獲得的轉基因蚊取食血液后,激活防御素的生物合成,并在血淋巴中大量積累,其體內活性能保持長達22ｄ。
3.3 抗菌肽的抗癌作用
抗菌肽不僅能作用于細菌、病毒以及其他一些原核生物,對腫瘤治療也能起到一定的作用。近年來,國內外競相報道了抗菌肽的抗癌作用?？咕淖饔糜诎┘毎?可使細胞膜破損,細胞內部結構發生明顯變化,線粒體出現空泡化,嵴脫落,核膜界限模糊不清,甚至核內容物外泄。抗菌肽還可以斷裂癌細胞的核ＤＮＡ,并抑制ＤＮＡ的再合成,從而殺死癌細胞[20]。另一方面,抗菌肽調動機體的免疫機能,從體液免疫方面起到抵抗癌細胞的作用。
4 昆蟲抗菌肽研究存在的問題及展望
抗菌肽具有分子量小、理化性質穩定、水溶性好、殺菌譜廣等優點。將昆蟲抗菌肽基因導入動植物,培育抗病新品種已成為一個非常誘人的研究領域,國內外均有成功的報道?？梢灶A測,作為新型抗生素及新型藥物,抗菌肽將在農業、食品業、工業、衛生用品和臨床醫學等方面發揮重要作用。但昆蟲抗菌肽分子小,易被蛋白酶降解,影響基因的高水平表達。此外,小分子物質的分離、純化比較困難,這些都是抗菌肽基因工程需要解決的問題?？咕囊患壗Y構和作用時的空間分子結構與生物活性的關系還需要進一步研究。
1 昆蟲抗菌肽的種類
昆蟲產生的抗菌多肽是昆蟲免疫的效應物。昆蟲的抗菌肽屬陽離子堿性多肽,大致可分為以下4類:第一類是天蠶素,含有31～39個氨基酸殘基,一般不含有半胱氨酸,由鱗翅目和雙翅目昆蟲產生。第二類是昆蟲防御素,含有38～43個氨基酸殘基,其結構與動物和某些植物的防御素相似。防御素大量存在于昆蟲血淋巴液中,至今已在雙翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目和蜻蜓目中發現了30多種防御素,主要殺死革蘭氏陽性菌。最近從果蠅中分離到抗菌多肽ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ,有38%的氨基酸序列與植物防御素相似,表明其與植物多肽的進化有一定的同源關系。第三類是分子量為2～4ｋＤ富含脯氨酸和精氨酸的抗菌肽,如從意大利蜜蜂中分離到的蜜蜂肽ａｐｉｄａｅｃｉｎ和ａｂａｅｃｉｎ(分子量分別為2.0ｋＤ和4.0ｋＤ)等,該類抗菌肽主要抑制革蘭氏陰性菌。第四類是分子量為8～30ｋＤ,富含甘氨酸的蛋白,如從麻蠅幼蟲體內分離到的麻蠅毒 素Ⅱ(ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎⅡ,分子量約為27ｋＤ),從綠蠅幼蟲、粉甲幼蟲蟲體中分離到的雙翅肽ｄｉｐｔｅｒｉｃｉｎ(分子量約為9ｋＤ)和鞘翅肽ｃｏｌｅｏｐｔｅｒｉｃｉｎ等,這些大肽間相互關系較遠,屬樗蠶素(ａｔｔａｃｉｎ)的超家族成員。
2 昆蟲抗菌肽的抗菌作用機理
昆蟲受傷后能誘導血細胞和脂肪體迅速產生并釋放大量不同組分抗菌肽進入血液,殺死外來細菌,這些抗菌肽合成類似于免疫應答反應和哺乳動物急性期反應。這些基因的表達受κＢ相關模式調控元件,與哺乳動物中相類似的調節編碼免疫和應急期蛋白基因的ＮＦ κＢ相關的反式激活蛋白二者共同調控[3]。
當抗菌肽基因在體內通過細菌的脂多糖類(ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ,ＬＰＳ)或死亡的細胞誘導表達時,外來的刺激信號激活轉錄激活因子ＮＦ κＢ,激活的ＮＦ κＢ識別并結合到抗菌肽基因5′Ｂ 上游的一段特定區域,從而激活抗菌肽基因的表達[4,5]。表達后產生的抗菌肽在水溶液中沒有穩定的構象,只是在結合或接近細胞膜時才形成高級結構。對此有學者分別提出各自的觀點:Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ等[6]認為,當抗菌肽與細胞膜疏水區域接觸時,整個分子(從Ｎ端到Ｃ端)誘導出兩親性螺旋,抑菌過程可能首先是抗菌肽Ｎ端的帶電氨基酸與細胞膜的極性集團靜電吸引,并形成α 螺旋,沿螺旋軸翻轉,嵌入細胞膜,破壞膜結構。Ｆｉｎｋ等[7]研究表明,抗菌肽Ｎ端(殘基1～11)形成兩親性螺旋,中間部分(殘基12～24)形成彈性轉角,Ｃ端形成疏水螺旋。當抗菌肽作用于細胞膜時,Ｃ端疏水螺旋插入膜中,Ｎ端結合在膜表面,中間由彈性轉角相連。Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等[8]提出,抗菌肽通過靜電作用被吸引到膜表面,然后疏水性尾巴插入細胞膜中的疏水區域,通過改變膜構象,多個抗菌肽聚合在膜上形成離子通道。在上述的4類抗菌多肽中,天蠶素和防御素的抗菌機理研究得最為詳細。
2.1 天蠶素的抗菌機理
天蠶素為陽離子型分子,含有2個α 螺旋結構,此結構具有雙親和性。Ｎ 末端具有親水性并含堿性氨基酸。含有堿性氨基酸的堿性部位與細菌細胞膜的磷脂親和,疏水部位貫穿細菌細胞膜,從而使細菌細胞膜的電動勢消失,ＡＴＰ含量迅速減少,這樣使細菌細胞膜機能喪失,細菌死亡。Ｃ 末端氨基酸的酰氨化對于抗菌蛋白保持其抗菌活性是極為重要的[9]。
2.2 防御素的抗菌機理
昆蟲防御素對革蘭氏陽性、陰性菌均有殺傷作用。相對而言,對革蘭氏陽性菌殺傷力更強,這可能是革蘭氏陰性菌的細胞壁防礙防御素接觸細胞膜。防御素分子含有6個半胱氨酸,形成3個二硫鍵,具有穩定的分子結構。這一結構與從哺乳動物體中分離到的防御素分子結構相同。防御素類抗菌肽的殺菌機理也是防御素分子作用于細菌細胞膜。分子中的二硫鍵與細菌細胞膜的心肌磷脂有很強的親和作用。結合后形成離子通道,從而改變細胞膜的透性,將細菌殺死。防御素的殺菌活性中心部位為α 螺旋結構[10]。Ｃ 末端氨基酸的酰氨化對其保持抗菌活性也是極為重要的。研究發現,防御素附著在細菌表面后,除了本身對細菌的損傷外,還可以使細菌被吞噬細胞吞噬消化,起到調理素的作用。另有研究表明,過氧化氫(Ｈ2Ｏ2)與防御素有協同作用,此協同作用隨Ｈ2Ｏ2濃度的增加而增加,使防御素易于進入其靶細胞膜或細胞內環境。此外,研究表明樗蠶素類抗菌肽的抗菌機理是阻礙細菌外膜蛋白的合成,富含甘氨酸類抗菌肽的抗菌機理是阻礙細菌肽聚糖的合成。
3 昆蟲抗菌肽的應用
3.1 轉抗菌肽基因植物
昆蟲抗菌肽對植物病原菌也表現出極強的抗菌活性。用基因工程方法將真核生物編碼抗菌肽的基因導入作物并得以表達,以達到抗菌的目的是當前國內外研究的熱點。Ｊａｙｍｅｓ[11]將天蠶素Ｂ基因導入煙草植株中,培育出抗煙草青枯病(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ)的煙草植株。Ｂｅｌｔａｎ等[12]將天蠶素Ｂ類似物ＳＢ 37的基因轉入煙草中,發現可推遲煙草的發病時間,并可以降低發病率和死亡率。另有報道將ａｔｔａｃｉｎＥ基因轉入蘋果樹可提高蘋果樹對梨火疫病(Ｅｒｗｉｎｉａａｍｙｌｏｖｏｒａ)的抗性[13]。最近有研究表明,編碼一種穩定的ｃｅｃｒｏｐｉｎ類似物ＭＢ39的基因在轉基因煙草中表達可抗煙草野火病(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ.ｔａｂａｃｉ)[14]。
國內也已研究出抗煙草花葉病毒病(Ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ,ＴＭＶ)的轉基因煙草。簡玉瑜等[15]將天蠶素Ｂ基因轉入水稻,培育出抗水稻白葉枯病(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ.ｏｒｙｚａｅ)的植株。賈士榮等[16]自1986年開始選定昆蟲細胞產生的抗菌肽天蠶素進行馬鈴薯抗青枯病基因工程的研究,改造并構建了比天蠶素抗性能力更強的ｃｅｃｒｏｐｉｎＢ、ｓｈｉｖａＡ及ＷＨＤ等抗菌肽基因,并導入我國7個馬鈴薯主栽品種中,轉化出1050個轉基因株系。
3.2 轉抗菌肽基因動物
控制瘧疾、黃熱病等蚊傳疾病的主要手段是開發高效的藥物和疫苗,以及消滅傳播介體(蚊等),切斷傳播途徑。近年來通過遺傳工程的方法,將對病原生物有抑制作用的抗菌肽基因導入傳播介體(蚊)中,使其在昆蟲體內高效穩定的表達,從而切斷病原物的傳播途徑[17～19]。
在天蠶素Ｂ基礎上構建的雜合肽ｓｈｉｖａ 3對瘧原蟲(Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｐｅｒｇｈｅｉ)孢子的發育有毒害作用。在ｓｈｉｖａ 3基因前連接一個谷胱苷肽(ＧＳＴ)轉移酶基因,組成融合基因Ｇｓｔ ｓｈｉｖａ 3作報告基因,從而得到一種轉基因蚊子,此蚊子腸道內可合成并分泌ｓｈｉｖａ 3,因此可以用于控制人瘧疾的傳播[18]。最近Ｖｌａｄｉｍｉｒ等[19]以埃及伊蚊(Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ)卵黃原蛋白基因(ｖｉｔｅｌ ｌｏｇｅｎｉｎｇｅｎｅ,ｖｇ)啟動子連接一段防御素Ａ(ｄｅｆｅｎｓｉｎＡ,ＤｅｆＡ)基因,將ｖｇ ＤｅｆＡ整合到埃及伊蚊的基因組中,獲得的轉基因蚊取食血液后,激活防御素的生物合成,并在血淋巴中大量積累,其體內活性能保持長達22ｄ。
3.3 抗菌肽的抗癌作用
抗菌肽不僅能作用于細菌、病毒以及其他一些原核生物,對腫瘤治療也能起到一定的作用。近年來,國內外競相報道了抗菌肽的抗癌作用?？咕淖饔糜诎┘毎?可使細胞膜破損,細胞內部結構發生明顯變化,線粒體出現空泡化,嵴脫落,核膜界限模糊不清,甚至核內容物外泄。抗菌肽還可以斷裂癌細胞的核ＤＮＡ,并抑制ＤＮＡ的再合成,從而殺死癌細胞[20]。另一方面,抗菌肽調動機體的免疫機能,從體液免疫方面起到抵抗癌細胞的作用。
4 昆蟲抗菌肽研究存在的問題及展望
抗菌肽具有分子量小、理化性質穩定、水溶性好、殺菌譜廣等優點。將昆蟲抗菌肽基因導入動植物,培育抗病新品種已成為一個非常誘人的研究領域,國內外均有成功的報道?？梢灶A測,作為新型抗生素及新型藥物,抗菌肽將在農業、食品業、工業、衛生用品和臨床醫學等方面發揮重要作用。但昆蟲抗菌肽分子小,易被蛋白酶降解,影響基因的高水平表達。此外,小分子物質的分離、純化比較困難,這些都是抗菌肽基因工程需要解決的問題?？咕囊患壗Y構和作用時的空間分子結構與生物活性的關系還需要進一步研究。
